NY∕T 3237-2018 猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体检测方法(农业)
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ID： |
DB0DAB9F678C423F94FDEED3E60C22E3 |
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文件大小(MB)： |
0.37 |
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页数： |
9 |
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日期： |
2021-12-23 |
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ICS 11.220,B 41 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 3237一2018,猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA抗体,检测方法,Indirect ELISA for detection of antibodies against porcine reproductive and,respiratory syndrome virus,2018-05-07 发布2018-09 一01 实施,中华人民共和国农业农村部发布,目。昌,本标准按照GB/ T 1. 1-2009 给出的规则起草,本标准由农业农村部兽医局提出,本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAC/ TC 18 1)归口,本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所,本标准主要起草人:刘湘涛、田宏、陈奶、吴锦艳、尚佑军、何继军,NY/T 3237-2018,I,NY/T 3237-2018,猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA 抗体检测方法,范围,本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征间接ELISA 抗体检测方法的技术要求,本标准适用于猪繁殖与呼,2 规范性引用文件,下列文件对于本文,件。凡是不注日期的引,GB 19489,GB/ T 27401,3 缩略语,4,4. 1 猪繁,GP5 蛋白,4. 2 兔抗猪,试验前,4. 3 阳性对照血,猪繁殖与呼吸,阳性,4. 4 阴性对照血清,未免疫猪繁殖与呼,荧光检测PRRSV 抗体为阴,4.5 包被液,配制见附录B 中的B.1 ,4.6 PBS,配制见B.2 ,4. 7 洗涤液,配制见B.3 ,4.8 封闭液,配制见B.4 ,4. 9 稀释液,配制见B. 5 ,4. 10 底物溶液,抗体为,1,NY/T 3237-2018,配制见B.6 ,4. 11 终止液,配制见B.7 ,5 仪器及设备,5. 1 酶标测定仪,5.2 恒温培养箱,5. 3 微量移液器及配套吸头(20μL~ 200μL;100μL~l 000μL) ,5. 4 酶标板,5.5 1. 5 mL 离心管,5. 6 一次性注射器,5. 7 稀释槽,6 血清样本的处理,6. 1 血清样本的采集和处理,静脉采血，每头猪使用一个注射器，采血量不少于2mL 。将血液置于15 0C ~250C 静置2 h ，待其自,然凝固后， 20C ~ 80C 冰箱中静置不少于2 h ,4 000 r/ min 离心10 min 。用移液器小心吸出上层血清,6. 2 血清样本的储存与运输,一周以内检测的血清样本可置于20C ~80C 冰箱中保存，保存时间超过一周的样本应置于-20 0C 以,下冷冻保存。低温运送并及时送达，以确保血清样本有效,7 操作方法,7. 1 PRRSV 重组抗原包被,取96 孔微量反应板，每孔加入用包被缓冲液稀释至工作浓度的PRRSV 重组抗原100 μL,( 5 μg/ mL) ，置4 0C 过夜,7. 2 洗板,弃去板中包被液，每孔加入220μL 洗涤液，重复洗3 次，甩掉洗涤液并在吸水纸上拍干残留液体,7. 3 加封闭液,每孔加人封闭液200μL ， 置于3 7"C 恒温箱内2h 。封闭结束后，弃去板中的封闭液，于吸水纸上拍,干后，置于4 0C保存备用,7. 4 加待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清,将待检血清、阳性对照血清及阴性对照血清用稀释液分别作1 : 20 稀释，每孔加人100μL ，每个待,检样品及对照血清做两孔重复，置于3 7"C 恒温箱内反应30 min ，取出反应板，弃去反应液，洗板同7. 2 ,7. 5 加酶标抗体,将兔抗猪IgG -辣根过氧化物酶用样品稀释液作1 : 40000 稀释至工作浓度，每孔加人1 00 μL ，置,于3 7"C 恒温箱内反应3 0min ，取出反应板，弃去反应液，洗板同7. 2 ,7. 6 加底物溶液,每孔加入底物溶液100μL( TMB) ，置于3 7"C 恒温箱内避光反应1 5 min ,7. 7 终止反应,每孔加人终止液(2 mol/L Hz S04 ) 1 00 μL ，终止反应,7. 8 读数,NY/T 3237-2018,在酶标测定仪上读取各孔吸光值(ODω nm) ,8 结果分析,8. 1 试验成立条件,在酶标测定仪上检测各孔光吸收值(ODω nm) .计算阳性对照平均ODωm 值和阴性对照平均,OD450 nm值。阳性对照平均OD450 nm值> 1. 0 ，阴性对照平均OD450 nm值<0.2. 试验成立,8. 2 结果判定,计算待检血清平均OD450 nm值和阴性对照孔平均OD450 nm值之比。当样品孔平均OD450 nm值(5) 与阴,性对照平均OD450 nm值(N) 之比不低于2. 4( 即5/ N二三2 . 40) 时，判定为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳,性;当样品孔平均OD450 nm值(5) 与阴性对照平均OD450 nm值(N) 之比小于1. 90( 即5/ N< 1. 90 时) .判定,为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴d性;当5/ N 介于1. 90 和2.40 之间则判定为可疑，应重测，重测后,5/ N二三2.40 判定为阳性， 5/ N< 2. 40 判定为阴性,9 注意事项,9. 1 所有操作应严格按照GB 19489 和GB/ T 27401 的规定执行,9.2 所有试剂需在20C~80C 保存，使用前恢复至室温,9. 3 操作时，注意取样、稀释准确、移液器进行校准，并注意更换吸头,9. 4 底物溶液和终止液对眼睛、皮肤及呼吸道有刺激性作用，使用过程应注意防护，防止直接接触和,吸人,9. 5 底物溶液应避光保……
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